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上海通蔚生物幾招搞定細(xì)胞株純化方法
更新時(shí)間:2022-07-12   點(diǎn)擊次數(shù):2057次

上海通蔚生物提供免費(fèi)代測(cè),數(shù)據(jù)分析,技術(shù)服務(wù),是多家高校認(rèn)可的酶免代測(cè)機(jī)構(gòu),可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,的產(chǎn)品質(zhì)量,低廉的市場(chǎng)價(jià)格,產(chǎn)品實(shí)惠、經(jīng)濟(jì)、可靠!

細(xì)胞株分離的方法有多種,常用的是機(jī)械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法,下面我們就介紹酶解聚方法獲得純化的細(xì)胞株。

(1)純化法

在去除不需要的組織后,使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片,通過懸浮在無鈣鎂的中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀,去除上清液。重復(fù)清洗2到3次。

將盛有組織碎片的容器置于冰上,去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的(100 mg組織加入1ml )。

在4℃孵育6到18小時(shí),使幾乎沒有活性的酶盡可能滲透進(jìn)去。

移棄組織碎片中的,在37℃孵育包含殘留的組織碎片20到30分鐘。

在組織碎片加入熱的*培養(yǎng)基,用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基,要加入大豆抑制劑。

通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)(100~200 mm)過濾,分散所有剩余組織。計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞,進(jìn)行培養(yǎng)。

(2)膠原酶純化法

用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,用Hanks'平衡液(HBSS)清洗組織碎片幾次。

加入膠原酶(50~200單位/ml,溶解在HBSS中)。

在37℃孵育4到18小時(shí)。加入3mM CaCl2增加解離效率。

通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液,以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚,在碎片中加入新鮮的膠原酶。

通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。

再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞,計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞,進(jìn)行培養(yǎng)。

(3)Dispase純化法

用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,用不含鈣鎂的清洗組織碎片幾次。

加入Dispase(0.6~2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的

在37℃孵育20分鐘到幾個(gè)小時(shí)。

通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液,以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進(jìn)一步的解聚,在碎片中加入新鮮的Dispase。

通過離心在中清洗懸液幾次。

再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞,計(jì)數(shù)和接種細(xì)胞,進(jìn)行培養(yǎng)。

分離細(xì)胞后,首ci傳代需要注意的問題:

傳代培養(yǎng)時(shí)先觀察細(xì)胞的活性。

細(xì)胞的活率應(yīng)該超過90%,密度控制在80%左右

對(duì)于無血清培養(yǎng)基,需要降低使用量。

(1) 移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基。

(2)使用不包含有鈣鎂的或EDTA清洗細(xì)胞。在培養(yǎng)瓶背著細(xì)胞的一面加入清洗溶液,通過轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細(xì)胞層,然后去除清洗液。

(3)加入消化,消化細(xì)胞與細(xì)胞,操作手法,試劑的效價(jià)有密切的關(guān)系,消化時(shí)應(yīng)注意觀察細(xì)胞形態(tài),如細(xì)胞變得橢圓透亮,并且可以觀察到細(xì)胞與細(xì)胞間的間隙時(shí),輕拍瓶身可以看見成流沙狀,即可中止消化,消化時(shí)盡量減少對(duì)細(xì)胞的吹打。

(4)當(dāng)細(xì)胞*分離時(shí),垂直放置培養(yǎng)瓶,讓細(xì)胞流到培養(yǎng)瓶的底部。在培養(yǎng)瓶中加入*培養(yǎng)基中止消化,計(jì)數(shù)并再次培養(yǎng)細(xì)胞。

(5)對(duì)于無血清培養(yǎng)基,加入大豆抑制劑。通常使用1∶1(v∶v)0.25 mg/ml抑制劑到中將抑制活性。


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